asyan.org
добавить свой файл
1 2
Метод радіоавтографії

Радіоавтографія, визначення, історія.

Метод радіоавтографії заснований на введенні в досліджуваний об'єкт з'єднання, "міченого" радіоактивним атомом і виявленні місця його включення шляхом фотографічної реєстрації випромінювання. Основою одержання зображення є вплив іонізуючих часток, що утворюються при розпаді радіоактивного атома, на ядерну фотоемульсію, що містить кристали галоидного срібла.

Відкриття методу радіоавтографії прямо пов'язане з відкриттям явища радіоактивності. В 1867 році було опубліковано перше спостереження про вплив солей урану на галогениды срібла (Niepce de St.Victor). В 1896 році Генрі Беккерель спостерігав засвечивание фотопластинки солями урану без попередньої експозиції на світлі. Цей експеримент уважається моментом відкриття явища радіоактивності. Радіоавтографію стосовно до біологічного матеріалу вперше використовували Лакассань і Латтье (Lacassagne, Lattes 1924) в 20-х роках минулого століття; гістологічний блок від різних органів тварин після введення їм ізотопів притискали плоскою стороною до рентгенівської пластинки й експонували. Заздалегідь одержували гістологічний зріз і піддавали стандартній процедурі фарбування. Отриманий автограф вивчали окремо від зрізу. Цей метод дозволяє оцінити інтенсивність включення ізотопу в біологічний зразок. У сорокових роках Леблон використовував радіоавтографію для демонстрації розподілу ізотопу иода в зрізах щитовидної залози (Leblond C.P. 1943).

Перші спроби поєднувати радіоавтографію з електронною мікроскопією були зроблені в 50-е роки (Liquir-Milward, 1956). Електронно-мікроскопічна радіоавтографія являє собою окремий випадок звичайної радіоавтографії, при якому також підраховуються зерна срібла й ураховується їхній розподіл. Особеннось методу полягає в застосуванні дуже тонкого шару емульсії. У цей час досягнуте дозвіл близько 50 нм, що в 10-20 раз вище в порівнянні зі світловою мікроскопією.

У цей час метод радіоавтографії доповнений можливістю автоматичної оцінки кількості зерен срібла за допомогою відеоаналізаторів. Часто для посилення сигналу мітки ( як правило це ізотопи з високими енергіями) застосовуються різні види сцинтиляторов, нанесені на пластини (посилюючий екран з фосфорним покриттям), або импрегнированные в емульсію (PPO) – у такому випадку випромінювання фотонів засвічує звичайну фотопластину або фотоплівку.
^ Фотографічний принцип одержання зображення, фотоемульсії

У радіографічному дослідженні роль детектора ядерних розпадів виконує фотоемульсія, у якій при проходженні іонізуючої частки залишається сховане зображення, що виявляється потім у процесі проявлення, аналогічно обробці звичайної фотоплівки.

Фотоемульсія представлет із себе зваж мікрокристалів галоидного срібла в желатині. Мікрокристали мають дефекти в структурі, називані центрами чутливості. Згідно з моделлю Гэрни-Мотта ці порушення іонних ґрат кристала здатні захоплювати електрони, що вивільнилися при проходженні альфа- або бета-частинки в зоні провідності кристала, у результаті чого іон перетворюється в атом. сховане зображення, Що утворювалося, може бути виявлене за допомогою процедури, у результаті якої активовані кристали галоидного срібла перетворюються в зерна металевого срібла (цей процес називається хімічним проявленням). У якості проявника може бути використаний будь-який агент із достатньою активністю, що відновлює (типово у світлині й авторадіографії використовуються метол, амідол або гідрохінон). Після прояву експонованих кристалів інші мікрокристали галоидного срібла видаляють із емульсії за допомогою фіксатора (звичайно - гипосульфит). Ядерні фотоемульсії характеризується розв'язною здатністю (зернистістю) і чутливістю. Перша визначається розміром мікрокристалів солі срібла й обернено пропорційна останньої. Фотоемульсія характеризується зниженою чутливістю до видимого світла, але робота з нею, проте, повинна проводиться в темряві, щоб виключити поява артефактів.

Емульсія може наноситься на препарат у вигляді готової плівки з подложкой або зануренням препарату в розігріту рідку емульсію – у такий спосіб виходить тонкий рівномірний шар, який проявляється звичайним способом. Перед нанесенням емульсії для світлової мікроскопії препарат звичайно офарблюють необхідним гістологічним фарбуванням, але більш блідо, ніж звичайно, щоб уможливити підрахунок зерен срібла на всіх ділянках. Певний час препарат експонують, потім проявляють.
Ізотопи, використовувані в радіоавтографії.

У радіоавтографії залежно від цілей дослідження й доступних матеріалів можливе застосування різних ізотопів. Зображення, створюване іонізуючої часткою на ядерній фотоемульсії залежить від енергії частки й типу її взаємодії з речовиною.
Альфа-частинки, що випускаються однаковими радіоактивними ядрами мають однакову енергію (^ E) і однаковою довжиною пробігу (R), зв'язаними наступним співвідношенням:
R = ke3/2
Де k – константа, що характеризує середовище, у якому поширюються частки. Величина пробігу часток у серде визначається її щільність і елементарним складом. Співвідношення Брегга-Климена дозволяє по величині пробігу альфа-частинок у повітрі (R0 ) оцінити пробіг у речовині з атомною масою A і щільністю d:

R=0,0003 ( R0 / d ) A1/2
Оскільки іонізуюча здатність альфа-частинок дуже висока, це полегшує фотографічну реєстрацію розподілу ізотопу, а так само дозволяє використовувати для реєстрації неемульсійні матеріали. Слід альфа-частинок, що випускаються одним джерелом, на автографах виглядає як пучок прямолінійних відрізків, звичайно довжиною 15-50 мкм, що виходять із однієї крапки, що дозволяє точно локалізувати ділянка включення радіоактивної мітки. Однак, альфа-частинки випускаються ізотопами з більшими атомними номерами, що обмежує можливість їх застосування як біологічної мітки.

Треки альфа-частинок часто спостерігаються в гістологічних радиовтографах як артефакт – результат власного випромінювання ізотопів, що перебувають у предметному склі.
Бета випромінювання характеризується безперервним спектром початкової енергії часток – від нуля до певної для кожного ізотопу E max. Форми спектра суттєво відрізняються. Так, найбільш імовірна енергія часток, випромінюваних тритем становить 1/7 від E max, 14C – близько ¼, 32P – близько 1/3. Максимальна енергія бета-випромінювання різних ізотопів міняється в межах від 18 кэв до 3.5 Мэв – у набагато більш широких межах, чому альфа випромінювання. Як правило, максимальна енергія вище в короткоживущих ізотопів.

Проходження бета-частинок і моноэнергетических електронів через речовину супроводжується двома основними типами взаємодії. При взаємодії з орбітальним електроном частка може передати йому енергію, достатню для іонізації атома (видалення електрона з орбіти). У рідких випадках ця енергія настільки велика, що можна спостерігати трек звільненого електрона. Через рівність мас частки й електрона відбувається відхилення від первісного руху. Взаимодествие другого типу, з атомними ядрами, приводить до виникнення гальмівного рентгенівського випромінювання. Хоча останнє й не реєструється емульсією, акт взаимодейтсвия частки з ядром може бути виявлений по різкому зламу траєкторії.

Багаторазова взаємодія з орбітальними електронами приводить до скривлення траєкторії, яка звичайно виглядає як звивиста лінія, особливо в кінцевій частині, коли швидкість частки падає, а іонізуюча здатність зростає. Довжина траєкторії помітно перевищує відстань від початкової до кінцевої крапки треку – пробіг. Із цієї причини навіть для моноэнергетических електронів характерна наявність спектра пробігів, обмеженого зверху R max, харакерным для даного випромінювання. Через більш низькі іонізаційні втрати бета частки реєструються з більшими складностями, чому альфа-частинки. Вони не утворюють суцільних треків ( крім самого м'якого випромінювання тритію – однак у цьому випадку мала ймовірність проходження більш чемп через один кристал емульсії), щільність і число виявлених кристалів варіюють у різних межах. Пробіг бета-частинки в іншому елементі може бути оцінений по формулі:

R = RA1 (Z/A)A1/ (Z/A)

У широкому діапазоні значень Emax максимальний пробіг пов'язаний з максимальною енергією співвідношенням:

Rm = 412 Emax1.265 – 0,0954 ln Emax

Відмінність у пробігах, іонізаційній здатності й щільності виявлених емульсійних кристалів у часток з різною енергією може бути використане для дискримінації розподілу елементів, эсли їх ізотопи суттєво відрізняються по E max, як у випадкові із тритієм і 14С. Дискримінацію розподілу двох ізотопів здійснюють за допомогою нанесення на зразок двох емульсійних шарів, перший шар реєструє переважно м'яке випромінювання, другий – тверде. Згідно з деякими роботами різні ізотопи можуть бути надійно виділені по розміру виявлених емульсійних кристалів - кристали, порушені бета-частинкою тритію, що володіє більшою іонізаційною здатністю, мають більші розміри.

Електрони внутрішньої конверсії утворюються при поглинанні гама кванта з дуже низькою енергією випромінювання й видаленні електрона із внутрішньої оболонки атома. Ці електрони подібні м'яких бета-частинок, але на відміну від останніх є моноэнергетическими. Наявність електронів внутрішньої конверсії дозволяє використовувати такі ізотопи як 125I.
У цей час найчастіше використовуються ізотопи, що випромінюють бета-частинки. Як правило для мітки в гістологічних дослідженнях використовується тритій. Перші автографи з використання тритію були виготовлені ще в 50-е роки (Fitzgerald et al. 1951), однак широке його застосування почалося після того, як у Брукхэвенской лабораторії був отриманий мічений тритієм тимидин. Оскільки водень входить до складу всіх органічних речовин, те, використовуючи тритій, можна одержувати самі різні з'єднання, що несуть радіоактивну мітку. Чим менше енергія частки, що випускається, тем коротше трек, що залишається їй при русі у фотоемульсії й тем точніше можна локалізувати розташування міченого ата. Довжина пробігу бета-частинок тритію близько 1-2 мкм, найбільш імовірна енергія 0,005 Мэв, а трек полягає в більшості випадків з одного зерна срібла, що дозволяє локалізувати джерело випромінювання не тільки у відносно великих клітинних структурах, таких як ядро, але й в окремих хромосомах.

Уведення "мічених" метаболітів в організм дозволяє простежити включення ізотопу в клітини тканин тварину, що дає можливість досліджувати самі різні біохімічні процеси в живому організмі.

Одержання абсолютних даних – концентрації міченої речовини в досліджуваному об'єкті рідко буває метою радіоавтографічного дослідження, для цього необхідно знання ряду умов, визначення яких утруднено. Тому кількісні радіоавтографічні дослідження звичайно проводять шляхом порівняння концентрації зерен срібла над досліджуваним об'єктом і контролем, при цьому контрольні дані зручно ухвалювати за одиницю, або 100%.

^ Характеристики деяких ізотопів, використовуваних

у радіоавтографії біологічних об'єктів

Изтоп

Період напіврозпаду

Частка

Максимальна енергія випромінювання

3H

12.35 років

-

0.019 МэВ

14C

5730 років

-

0.155 МэВ

35S

87.4 дня

-

0.176 МэВ

32P

14.3 дня

-

1.709 МэВ

45Ca

164 дня

-

0.250 МэВ

Бета-частинки радіоактивного фосфору здатні пролітати в ядерній емульсії відстані до декількох міліметрів, трек складається з десятків рідко розташованих часток срібла – так, радіоактивний фосфор може бути использовани тільки для вивчення розподілу ізотопу в тканинах, локалізацію в окремих клітинних структурах установити неможливо.

Радіоактивні сіра й вуглець можуть бути використані для локалізації ізотопу в окремих клітинах, за умови того, що вони великі або розташовані на достатній відстані друг від друга, що може бути досягнуте в мазках крові або клітинних суспензіях.
^ Розв'язна здатність і погрішності методу, помилки методу.

Під розв'язною здатністю розуміють ступінь точності з якої можна визначити локалізацію в препараті радіоактивної речовини («мітки»). Розв'язна здатність методу в цьому випадку обмежено двома факторами.

^ Геометрична помилка – у зв'язку з тим, що частка, що випускається, може бути спрямована під будь-яким кутом до поверхні фотошару. Отже, зерно срібла у фотошарі може бути розташоване не точно над радіоактивним атомом, а більш-менш зміщене залежно від напрямку руху частки й довжини пробігу (енергії).

Фотопомилка виникає у зв'язку з тим, що зерно срібла, що полягає з тисяч атомів металу набагато більше, ніж радіоактивний атом. Таким чином, про локалізацію меншого об'єкта доводиться судити виходячи з положення більшого.

При використанні тритію, що характеризується малою енергією (пробігом) часток, що випускаються, і ядерних фотоемульсій з низькою зернистістю розв'язна здатність методу радіоавтографії лежить у межах розв'язної здатності оптичних систем – 1 мкм. Таким чином, ці помилки не мають істотного впливу на одержуваний результат.

Для досягнення кращого дозволу необхідно зменшувати товщину зрізу, шаруючи емульсії й відстань між ними. Препарат слід небагато недоекспонувати.

^ Ефект автоабсорбции: Число зерен срібла залежить від ступеня поглинання випромінювання клітинними структурами, завдяки малому пробігу й малої енергії бета-частинок, їх абсорбція в тканинах досить велика, що може приводити до втрати мітки, тому важливе значення набуває питання про товщину зрізів. Показане, що число зерен срібла пропорційно радіоактивності тканини тільки при товщині зрізу не більш 5 мк.

Відносне число бета-частинок, що пройшли крізь шар поглинача товщиною х може бути оцінене за законом Бера –
Nx/N0 = e - x

Де  - коефіцієнт поглинання (величина, зворотна товщині шару, при проходженні якого число часток зменшується в e раз. Величину коефіцієнта поглинання можна приблизно оцінити по величині Rm (максимальний пробіг), відомої для всіх ізотопів, за допомогою співвідношення  Rm = 10, слушного для не занадто твердих випромінювань.

Якщо в шарі одиничної товщини в одиницю часу виникає n часток, що рухаються до поверхні, то в зразку товщиною х поверхні досягнеться N часток:
N =
^ Тло й артефакти: Помилку у виміри можуть вносити так само механічні впливи – подряпини, тріщини емульсії, що ведуть до утвору схованого зображення й фонове випромінювання, яке необхідно враховувати при обробці радіоавтографів. Тло враховують підрахунком числа зерен срібла на порожній ділянці препарату. Помилки так само вносяться в результаті гістологічної обробки зрізів – проводки по спиртах (дегідратації), висновку в парафін, фарбування. Ці процедури можуть впливати на розміри й співвідношення клітинних структур.

^ Радіаційний ефект мічених метаболітів: Завдяки малій енергії випромінювання тритій викликає в клітині значну іонізацію, що набагато перевищує радіаційний ефект бета-частинок вуглецю. Внаслідок цього при тривалій дії міченого з'єднання наприклад 3 H-нимидина відбувається руйнування й загибель клітин, що приводять до зупинки росту тканин. У першу чергу порушується сперматогенез. Є дані про мутагенну й канцерогенну дію мічених метаболітів. Спостережувані цитологічні зміни полягають у порушенні проходження клітинами митотического циклу, зміні плоидности клітин і появі хромосомних аберацій. Але, очевидно дія, що ушкоджує, ізотопу на клітини мождет помітним образом позначатися на результатах дослідження лише в умовах тривалого експерименту.


следующая страница >>