asyan.org
добавить свой файл
  1 2 3 4 5

Публікації. Основні положення роботи висвітлено в 24 статтях у виданнях, що включені до Переліку наукових фахових видань України (з них 7 без співавторів); у 20 тезах у матеріалах наукових з’їздів та конференцій; в 1 патенті України на корисну модель, 1 реєстраційній картці технології, 1 інформаційному листі, 3 медико-біологічних нововведеннях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена за загальноприйнятою формою на 254 сторінках друкованого тексту, складається зі вступу, огляду літератури, розділу власних досліджень із 8 глав, аналізу та узагальнення результатів, висновків та практичних рекомендацій, списку літературних джерел, що містить 77 україно- та російськомовних назви й 370 – на інших мовах. Робота ілюстрована 22 таблицями, 29 рисунками та 11 клінічними прикладами.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Загальна характеристика обстежених хворих та методи досліджень. Для реалізації поставлених у роботі завдань було проведено клініко-лабораторне обстеження 84 хворих (віком від 18 до 69 років), які знаходилися під спостереженням в Обласній клінічній інфекційній лікарні м. Харкова в період з 2005 по 2011 рр.

Критеріями включення в дослідження на етапі розробки бактеріологічного методу діагностики – виділення чистої культури бартонел (9 осіб) були: 1) епідеміологічні: “травматичний” контакт із кішкою, що передував захворюванню; 2) клінічні: наявність подряпин, укусів або ослинення; наявність первинного афекту через 3-10 днів після нанесення кішкою подряпин, укусів або ослинення; розвиток лімфаденіту (через 14-28 днів після “травматичного” контакту), що характеризувався переважним збільшенням одного лімфовузла, його болючістю, гіперемією шкіри над ним, нагноєнням, відсутністю лімфангіту, тривалим збереженням (до 4 тижнів і більше); відсутність інтоксикації або помірна її вираженість. Критерії включення в дослідження на етапі розробки та апробації сероімунологічних методів діагностики (75 осіб) складалися з вищезазначених та були розширені наступними: 1) епідеміологічні: контакт з іншими, крім кішок, тваринами та подряпини рослинами або дротом; 2) клінічні: тривала гарячка, полілімфоаденопатія, гепатоспленомегалія. Критеріями включення в дослідження на етапі апробації молекулярно-генетичних методів діагностики (18 осіб) були: 1) маніфестна форма бартонельозу; 2) позитивний результат бактеріологічного аналізу та/або наявність сумарних специфічних antiBartIg.

За допомогою лабораторних методів діагностики маніфестну форму бартонельозу (ХКП й БА) встановлено у 59 осіб. Співвідношення за статтю було наступним: кількість жінок у 1,5 рази перевищувала кількість чоловіків, відповідно 59,3% та 40,7% (p<0,05). У віковій структурі переважали особи молодші за 30 років – 57,7%. Середній вік склав 30,3±1,6 років. Статистично достовірних вікових відмінностей залежно від статі не було встановлено (p>0,05).

Для встановлення циркуляції збудників бартонельозу нами серед населення Харківської області в ЛНМІЗ ДУ “ІМІ ім. І.І. Мечникова НАМНУ” проведений моніторинг наявності специфічних antiBartIg у 80 клінічно здорових осіб (донорів Харківського обласного центру служби крові МОЗ України). Розподіл за статевою ознакою був наступним: чоловіки склали 59%, жінки – 41%. Вік обстежених коливався від 20 до 57 років і в середньому складав 34,1±1,2 роки.

Для встановлення циркуляції збудників бартонельозу серед однієї з категорій ризику зараження проведений моніторинг наявності специфічних antiBartIg у 176 ВІЛ-інфікованих осіб на різних стадіях захворювання, які знаходились на обліку в ОЦПБС м. Харкова або проходили лікування в Обласній клінічній інфекційній лікарні м. Харкова та спеціалізованій туберкульозній лікарні при Жовтневській виправній колонії (№ 17). Діагноз ВІЛ-інфекції в усіх обстежених пацієнтів встановлювали згідно клінічної класифікації стадій ВІЛ-інфекції у дорослих та підлітків (ВООЗ, 2006 р.) після скринінгового, референтного та експертного досліджень на наявність специфічних антитіл до ВІЛ методами імуноферментного аналізу та імуноблотингу. Зразки сироватки крові для моніторингу рівня antiBartIg були взяті з інформованої згоди пацієнтів. Розподіл за статевою ознакою був наступним: чоловіки склали 56,3%, жінки – 43,8%. Вік обстежених коливався від 20 до 60 років, середній вік склав 33,0±0,5 роки.

Програма загальноклінічного обстеження ВІЛ-інфікованих включала: 1) оцінку скарг і анамнестичних відомостей з детальним аналізом медичної документації (амбулаторні карти, стаціонарні історії хвороби); 2) фізикальний огляд; 3) дослідження периферичної крові з використанням гематологічного аналізатора ABX PENTRA 60C Plus (HORIBA ABX Diagnostics Inc., Франція); 4) імунофенотипування з використанням проточного цитофлюориметра EPICS™ XL™ (Beckman Coulter, США) в «Центральній лабораторії діагностики ВІЛ-інфекції, опортуністичних інфекцій і інших захворювань» при Сумському ОЦПБС. До аналізу також були включені дані серологічних і молекулярно-генетичних досліджень на наявність маркерів HBV, HСV, Toxoplasma gondii. Визначення рівня вірусного навантаження РНК ВІЛ-1 проводилося методом зворотної транскрипції і ПЛР у вірусологічній лабораторії Українського центру СНІДу з використанням тест-системи Abbott «Real-Time HIV-1».

Мікропрепарати (архівний матеріал патологоанатомічного відділення Обласної клінічної лікарні з центром екстреної медичної допомоги і медицини катастроф м. Харкова за 2008-2010 рр.) досліджували спільно зі співробітниками кафедри патологічної анатомії ХНМУ за допомогою мікроскопу “Olympus BX-41” з об’єктивами “Plan”. При проведенні імуноморфологічних досліджень використовували мікроскоп “Axioskop 40 (Carl Zeiss)” з об’єктивами “Achroplan”. За даними морфологічного дослідження 113 біоптатів лімфовузлів, які було отримано від хворих з лімфаденітами, а також 24 біоптатів від хворих з новоутвореннями шкіри ретроспективно діагноз ХКП встановлено в 17 випадках, а БА – в 3-х.

При вивченні біологічних властивостей бартонел і розробці методів етіологічної діагностики в якості типового використовували референтний штам Bartonella henselae CCUG 30454 BT із Culture Collection, University of Goteborg, Sweden, який було виділено науковцями США у 1992 році з крові ВІЛ-інфікованого хворого (представлений в інших колекціях мікроорганізмів під номерами: CDC G5436, ATCC 49882, CIP 103737). Вісім інших референтних штамів Bartonella spp. (ЛНМІЗ 06U051, 06U052, 06U053, 06U054, 06U055, 06U056, 06U061, 06U062) було виділено в 2005-2006 рр. в ЛНМІЗ ДУ “ІМІ ім. І.І. Мечникова НАМНУ” від хворих на бартонельоз. Штами інших мікроорганізмів отримано з музеїв живих культур ДУ “ІМІ ім. І.І. Мечникова НАМНУ”.

Для вирощування бартонел в якості основних ПС використовували шоколадний і кров’яний агари (КА). Застосовували два типи шоколадного агару: типовий (ТША) – виготовлений на основі 2%-го м’ясо-пептонного агару за традиційною рецептурою та оптимізований (ОША). Для ОША поживною основою був 2%-ий агар із мозково-серцевим екстрактом (BHIA) фірми “Fluka BioChemica”, Швейцарія. 5%-ий (об’єм/об’єм) КА готували з використанням крові людини, барана, кролика за традиційною технологією. Протестовані наступні ПС: 2%-ий м’ясо-пептонний агар та середовище для визначення антибіотикочутливості, 2%-ий BHIA, Луріа-Бертані агар і буферний вугільно-дріжджовий агар, еритрит-агар, казеїно-вугільний агар, молочно-жовтково-сольовий агар, середовище для гемокультур і стрептококів, агар Сабуро, агар Ендо, вісмут-сульфіт-агар і агар Плоскірєва, сироватковий агар, МРС 4.

В якості стимуляторів росту штамів бартонел з метою більш швидкого формування макроколоній на агаризованих середовищах було випробувано такі інгредієнти: гемін (Х-фактор росту); стимулятор росту чумного мікроба – (СРЧМ – компоненти гемолізованої крові барана, які містять Х- і V- фактори росту); суміш продуктів ферментативного гідролізу дріжджів – (ЕНКАД); суміш для стимуляції росту – (ДПД-суміш у співвідношенні 1:1:1 – дипіримідил піримідин (тетраметоксі)-етиканін 0,5%-ий стерильний розчин, тетраетил-тетраметоксі-феніл-ізохіноліну 2,0%-ий стерильний розчин, фенілметілбензімідазол 1,0%-ий стерильний розчин).

Стандартизовані у стерильному 0,15 М фосфатно-сольовому буфері (рН=7,0) до 0,023 за показником одиниць оптичної щільності суспензії штамів бартонел дозовано (по 10-1-10-4 мл) висівали на поверхню ПС. Культивування посівів здійснювали при tо=(350,5)oC в атмосфері з 5% СО2 впродовж від десяти до сорока діб (для створення необхідних умов використовували ексикатор).

Для постановки РНІФ в ЛНМІЗ ДУ “ІМІ ім. І.І. Мечникова НАМНУ” використовували імунобіологічні препарати: антивидові флюоресцюючі Ig проти Ig людини сухі, антивидові флюоресцюючі Ig проти Ig людини класів М (IgM) та G (IgG), антивидові флюоресцюючі Ig проти Ig кролика сухі, альбумін бика мічений родаміном сухий, виробництва “Филиал “МЕДГАМАЛ” ДУ “НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, РАМН” (м. Москва, РФ); антиген збудника Волинської гарячки (штами “Ш” і “Д”) сухий і специфічну імунну сироватку проти збудника Волинської гарячки суху виробництва “ФГУП Пермское НПО “Биомед” (м. Пермь, РФ); експериментальні зразки тест-систем для виявлення бартонельозного антигену та визначення рівня антибартонельозних антитіл. Лабораторний діагноз бартонельозу встановлювали на підставі одноразового дослідження сироватки крові за умови, що титр РНІФ був не нижчий за 1:128. В сумнівних випадках використовували РНІФ з окремим визначенням рівнів Ig класів М та G. Діагностично значущим враховували титр Ig класу М – 1:16 та вище, а Ig класу G – 1:64 та вище.

При відтворенні ПЛР в ЛНМІЗ ДУ “ІМІ ім. І.І. Мечникова НАМНУ” для детекції специфічних фрагментів геному Bartonella spp. у модельних і зразках клінічного матеріалу застосовували спеціальні набори реагентів фірми “IsoGene Lab. Ltd.” (м. Москва, РФ): “Комплект реактивов для универсальной пробоподготовки”; “Набор реагентов для выделения ДНК из биологического материала” – Diatom DNA Prep 100; “Набор реагентов для амплификации ДНК” – GenePak PCR Core; “Комплект реактивов для детекции ДНК” – GenePak DNA PCR test; “Маркер молекулярной массы ДНК М100” – GenePak DNA Ladder M100. Олігонуклеотиди, які використовувались в якості систем праймерів для відтворення ПЛР, на замовлення ЛНМІЗ ДУ “ІМІ ім. І.І. Мечникова НАМНУ” були синтезовані ТОО “ЛИТЕКС” (м. Москва, РФ).

Весь масив експериментальних даних, які були отримані в результаті проведених досліджень, обробляли у відповідності до правил параметричної і непараметричної статистики. Формування бази даних здійснювалося з використанням програми “Microsoft Excel 2007” (Microsoft Corporation). Статистичні процедури виконувалися в пакеті застосованих програм Statistica v.6.0 (StatSoft).

Результати досліджень та їх обговорення. У Харківській області бартонельоз реєструвався протягом усього року. Слід зазначити, що 84,7% випадків зареєстровано з вересня по квітень, а максимальна кількість випадків припадала на період з вересня по грудень (57,6%). Тривалість інкубаційного періоду у обстежених хворих коливалася від 2 до 14 днів і в середньому складала при типовій ХКП 9,2±5,1 днів, при інших варіантах – 7,7±4,4 днів. Контакт із кішками в анамнезі був у 76,3% хворих, із собаками – у 6,8%. Подряпини були у 66,1% хворих. З них у 1 хворого (1,7%) була подряпина, нанесена кролем і в 1 хворого була подряпина дротом. Укуси відмічали 15,3% осіб, ослинення слизової ока – 3,4%. Гострий початок захворювання відмічений у 59,3% хворих. Первинний афект (папула, везикула, пустула або виразка) в місці укусу або подряпини зареєстрований лише у 10% досліджених, що вказує на те, що в сучасних умовах він не може розглядатись як патогномонічний симптом. Тривалість захворювання коливалась від 10 діб до 6 місяців.

Серед клінічних варіантів домінувала типова ХКП, яка склала 69,5%. Окулогландулярна ХКП була зареєстрована в 3,4% та в такому ж відсотку зустрічались орофарингеальна ХКП та БА шкіри. Системний варіант зареєстрований в 20,4% випадків. У більшості випадків (64,4%) у досліджених хворих спостерігався легкий ступінь тяжкості. Середню тяжкість захворювання визначено у 35,6% пацієнтів, серед яких переважали жінки. Тяжкість бартонельозу визначали на підставі вираженості загальної інтоксикації, гарячки, а також характеру запалення лімфовузлів. Тяжкий ступінь не був діагностований у жодного хворого.

У більшості хворих (88,1%) був наявний лімфаденіт, який переважно локалізувався в місцях подряпин або укусів (59,3%); розміри ураженого лімфовузла варіювали від 3 до 15 см. Відмінною рисою ХКП є часте виникнення ізольованого лімфаденіту без інших симптомів, що спостерігалося нами в 50,8% хворих. Серед хворих із лімфаденітом у 44,2% до запального процесу був залучений один лімфовузол, у 25% – декілька регіонарних лімфовузлів, і в 30,8% відмічалась полілімфоаденопатія. У 10,1% обстежених спостерігалось абсцедування лімфовузлів. У частини хворих були прояви ураження лімфоїдної тканини верхніх дихальних шляхів у вигляді першіння в горлі (27,1%), сухого кашлю (20,3%), гіперемії задньої стінки глотки (37,3%). В 1,7% хворих спостерігалось ускладнення у вигляді ретрофарингеального абсцесу. Через 1-6 тижнів після появи регіонарного лімфаденіту в 20,3% хворих з’являлася висипка – скарлатиноподібна, краснухоподібна або вузлувата еритема. Зникала вона через 1-2 тижні, не залишаючи пігментації та лущення.

Аналіз клінічних симптомів (гарячка, загальна слабкість, нездужання, біль голови та ін.) показав, що інтенсивність і тривалість їх реєстрації істотно не відрізнялися від аналогічних, які були описані іншими авторами. Так, ремітуюча гарячка (на рівні 38-40°С) тривалістю від 1 до 4 тиж. із загальними симптомами інтоксикації спостерігалась у 35,6% хворих, в інших випадках гарячка була субфебрильною або зовсім не відмічалась. Загальна слабкість і нездужання (59,3%), біль голови (42,4%), анорексія (33,9%), нудота (15,3%), артралгії й міальгії (11,9%), абдомінальні болі (5,1%) реєструвалися на фоні гарячки.

Залучення до патологічного процесу печінки у вигляді її збільшення та помірного підвищення активності трансаміназ виявлене у 28,8% обстежених; помірне збільшення селезінки – у 30,5%. Ці симптоми спостерігались і в хворих без синдрому гарячки. В 8,5% хворих у гострому періоді захворювання діагностовано зміни з боку нервової системи у вигляді невритів і розладів шкірної чутливості локального характеру. Безсоння реєструвалося в 5,1% випадків, виражена пітливість – в 11,9%. У жодного хворого порушення з боку центральної нервової системи (менінгіти, енцефаліти) нами не відзначалися. Картина крові на початку хвороби характеризувалася лімфомоноцитозом. При нагноєнні лімфовузлів виникав нейтрофільний лейкоцитоз, збільшувалася ШОЕ.

Маніфестні форми бартонельозу у ВІЛ-інфікованих пацієнтів спостерігалися в 10 випадках. Розподіл за статтю був рівнозначним. Пацієнти були у віці від 24 до 39 років, середній вік склав 33±6,1 роки. За класифікацією ВООЗ у 6 випадках діагностовано III клінічну стадію ВІЛ-інфекції (категорії за класифікацією CDC, 1993: В1 – 2 хворих, В2 – 2, В3 – 2) і в 4 – IV стадію (категорії С2 – 1, С3 – 3, відповідно). Споживачами ін’єкційних наркотиків (СІН) були 50% обстежених. Туберкульоз, токсоплазмоз і HCV-інфекцію діагностовано у 40%, мікст HBV- і HCV-інфекцію – в 10%. За клінічними варіантами бартонельоз перебігав у вигляді БА в 5 хворих, бацилярного пеліозу – 1, ХКП – 1, тривалої гарячки – 2, бактеріємії з хронічною анемією – 1.

При БА і бацилярному пеліозі пацієнти мали клінічну симптоматику, яка включала гарячку, озноб, нездужання, біль голови, втрату апетиту, з або без втрати ваги. Шкірні ураження при БА були представлені поодинокими або численними безболісними маленькими сферичними червоно-фіолетовими папулами. ХКП без первинного афекту ми спостерігали в особи з III клінічною стадією.

Ретроспективний аналіз біопсій лімфовузлів хворих із гістологічно підтвердженою наявністю лімфаденіту, в яких у подальшому нами була серологічно підтверджена бартонельозна етіологія, показав, що бартонельозний лімфаденіт характеризується проліферацією ретикулярних клітин, появою велетенських багатоядерних клітин, виявленням скупчень гіпербазофільних клітин і еозинофілів. У більш пізніх стадіях характерним є склероз із картиною гіперплазії ретикулоендотеліальних елементів, збільшення центрів розмноження фолікулів і еозинофілією тканин. У цілому гістопатологічні особливості є вельми характерними, але не патогномонічними. Типовою для ХКП є комбінація в одному препараті гранульом і мікроабсцесів.

Проведення біопсії уражених лімфовузлів показане лише в атипових випадках у разі необхідності виключити діагноз відмінний від ХКП (туберкульоз, туляремія, паховий лімфогранулематоз та ін.). У типових же випадках біопсія лімфовузла не показана, враховуючи травматичність методу й додаткові витрати. Проведенню аспірації ураженого лімфовузла перешкоджає можливість формування свища. Специфічність фарбування може бути поліпшена шляхом використання імуноморфологічних методів, але їх застосування при типовій ХКП, враховуючи доброякісність перебігу, є недоцільним.

Біологічною особливістю B. henselae і B. quintana є унікальна здатність стимулювати проліферацію клітин ендотелію та розростання капілярів із розвитком БА. Незважаючи на те, що провідним методом діагностики БА є біопсія з наступним гістологічним дослідженням, встановлення діагнозу є дуже складним у зв’язку зі схожістю гістологічної картини з цілою низкою патологічних процесів.

Диференціальна діагностика БА базується на порівнянні маніфестної картини захворювання, результатів гістологічного дослідження біоптату та проводиться з саркомою Капоші, лімфомами, гемангіомами, піогенною гранульомою та іншими підшкірними пухлинами й інфекціями, при яких також спостерігається судинна проліферація. Діагностичною особливістю, яка відрізняє БА від іншої патології, є наявність бактерійних організмів. Продемонстрована нами можливість використання розробленої тест-системи для виявлення BartAg методом РНІФ у гістологічних зрізах вказує на високу специфічність імуноморфологічних досліджень.

Результати моніторингу поширеності antiBartIg, який був проведений серед мешканців Харківської області, були в межах загальних тенденцій. Так, в 56,3% клінічно здорових осіб визначались анамнестичні антитіла проти B. henselae, а в 77,5% – проти B. quintana (рис. 1).

Хворі на ВІЛ/СНІД знаходяться у групі високого ризику щодо виникнення різних опортуністичних інфекцій, у тому числі бартонельозів. Було встановлено, що antiBartIg в діагностичному титрі наявні майже в кожного третього ВІЛ-інфікованого, що свідчить про активний характер епідпроцесу (рис. 2). Інфікування встановлено в усіх вікових категоріях незалежно від статі (р>0,05).

На основі аналізу епідеміологічних даних у групі ВІЛ-інфікованих осіб встановлено, що серед СІН antiBartIg виявляються частіше (44,3%), у той час, як у групі осіб, що не споживають наркотики, лише в 25,2%.

Враховуючи тривалу внутрішньоеритроцитарну персистенцію бартонел та їхню здатність викликати хронічну бактеріємію в хазяїна, а також встановлений прямий зв’язок між наркозалежністю й інфікуванням бартонелами (χ2 = 6,66, p = 0,01; r = 0,19, p = 0,01), постає питання про можливість гемоконтактного шляху передачі бартонельозу.



Рис. 1. Рівні специфічних антитіл проти збудників бартонельозу в сироватках крові клінічно здорових людей (n=80)


Рис. 2. Рівні специфічних антитіл проти B. henselae в сироватках крові ВІЛ-інфікованих осіб (n=176)
Крім того, нами встановлений зв’язок між наявністю HCV-інфекції та бартонельозу (χ2 = 4,64, p = 0,03; r = 0,16, p = 0,03), при відсутності статистично достовірного зв’язку між HBV-інфекцією та бартонельозом (χ2 = 2,84, p > 0,05; r = 0,12, p > 0,05).

Аналіз виявлення маркерів HBV і HCV серед респондентів цього дослідження встановив, що одночасно маркери вірусних гепатитів В і С частіше зустрічалися у СІН, ніж у інфікованих ВІЛ статевим шляхом. Світова практика вказує на провідну роль СІН у підтримці епідемічного процесу не лише при ВІЛ-інфекції, але й інших інфекціях, до яких за нашими дослідженнями відноситься і бартонельоз.

Відомо, що поведінкові та імунологічні характеристики, що асоціюються з використанням наркотиків, також сприяють збільшенню поширеності патогенів, які не мають гемоконтактного шляху інфікування, як, наприклад, Mycobacterium tuberculosis. У обстежених нами осіб не встановлений достовірний зв’язок між інфікуванням мікобактеріями та бартонелами (χ2 = 2,56, p > 0,05; r = 0,12, p > 0,05).

Прямий зв’язок між інфікуванням токсоплазмами та бартонелами (χ2 = 4,42, p = 0,04; r = 0,16, p = 0,04) пояснюється високою поширеністю B. henselae серед котів, які є основним джерелом ХКП.

При проведенні аналізу клініко-лабораторних особливостей перебігу ВІЛ-інфекції на фоні бартонельозу нами не було встановлено статистично достовірного зв’язку між наявністю інфікування бартонелами та змінами в еритроцитарній, тромбоцитарній та лейкоцитарній ланках гемограми (табл. 1), попри те, що бартонели при маніфестних формах здатні викликати гемолітичні анемії, тромбоцитопенії та гнійно-запальні реакції.

Таблиця 1

Показники периферичної крові у ВІЛ-інфікованих осіб



<< предыдущая страница   следующая страница >>